Η απομόνωση του DNA από το Ε. Coli είναι μια θεμελιώδης διαδικασία στη μοριακή βιολογία. Αυτό το άρθρο θα σας οδηγήσει σε όλη τη διαδικασία, παρέχοντας λεπτομερή βήματα και εξηγήσεις, εξασφαλίζοντας ότι κατανοείτε τόσο την επιστήμη όσο και τις πρακτικές πτυχές της διαδικασίας. Είτε είστε έμπειρος ερευνητής ή νεοφερμένος στο εργαστήριο, αυτός ο οδηγός θα είναι ένας πολύτιμος πόρος.
Προετοιμασία κυτταρικής εναιώρησης
● Συλλογή κυττάρων Ε. Coli
Το πρώτο βήμα στην απομόνωση του DNA από το Ε. Coli περιλαμβάνει τη συλλογή των βακτηριακών κυττάρων. Αυτό συνήθως απαιτεί την ανάπτυξη του Ε. Coli σε κατάλληλο υγρό μέσο μέχρι να φτάσει στη φάση λογαριθμικής ανάπτυξης. Ο χρόνος είναι ζωτικής σημασίας επειδή τα κύτταρα σε αυτή τη φάση είναι πιο βιώσιμα και ευκολότερα να λυθούν, γεγονός που θα οδηγήσει σε υψηλότερη απόδοση του DNA.
● Επανατοποθετημένα κύτταρα σε κατάλληλο buffer
Τα συλλεγόμενα κύτταρα στη συνέχεια επαναιωρούνται σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα. Μια κοινή επιλογή είναι ένα buffer Tris - EDTA (TE), το οποίο βοηθά στη διατήρηση της ακεραιότητας του DNA κατά τη διάρκεια της διαδικασίας εκχύλισης. Το ρυθμιστικό διάλυμα εξυπηρετεί πολλαπλούς σκοπούς: σταθεροποιεί το ρΗ, χηλίζει τα δισθενούς κατιόντα που διαφορετικά θα μπορούσαν να υποβαθμίσουν το DNA και παρέχουν ένα βέλτιστο ιοντικό περιβάλλον για επακόλουθες ενζυματικές αντιδράσεις.
Φυγοκέντρηση σε κύτταρα σφαιριδίων
● Παράμετροι για φυγοκέντρηση (ταχύτητα και ώρα)
Μετά την επανεμφανοποίηση των κυττάρων, το εναιώρημα υποβάλλεται σε φυγοκέντρηση για να σφαιρέσει τα κύτταρα. Η ταχύτητα και ο χρόνος φυγοκέντρησης είναι κρίσιμες παράμετροι. Συνήθως, η φυγοκέντρηση πραγματοποιείται σε περίπου 4.000 - 6.000 g για 10 - 15 λεπτά στους 4 ° C. Αυτό εξασφαλίζει ότι τα κύτταρα σχηματίζουν ένα σφιχτό σφαιρίδιο στο κάτω μέρος του σωλήνα φυγοκέντρησης.
● Σημασία της σωστής σφαιριδίων
Το σωστό σφαιρίδιο είναι απαραίτητο για τον διαχωρισμό των κυττάρων από το μέσο ανάπτυξης και άλλα διαλυτά συστατικά. Ένα φρεάτιο που σχηματίζεται - σχηματίζεται καθιστά τα επόμενα βήματα ευκολότερα και αποτελεσματικότερα, εξασφαλίζοντας ελάχιστη απώλεια κυττάρων και επομένως μέγιστη απόδοση του DNA.
Αφαίρεση του υπερκείμενου
● Τεχνικές για την απομάκρυνση του υπερκείμενου
Μόλις τα κύτταρα είναι σφαιρισμένα, το υπερκείμενο (το υγρό πάνω από το σφαιρίδιο) πρέπει να απομακρυνθεί προσεκτικά χωρίς να διαταραχθεί το σφαιρίδιο των κυττάρων. Αυτό γίνεται συνήθως χρησιμοποιώντας μια μικροπιπέτα. Είναι σημαντικό να εκτελεστεί σχολαστικά αυτό το βήμα για να αποφύγετε την απώλεια οποιωνδήποτε κυττάρων.
● Εξασφάλιση ελάχιστης απώλειας κυτταρικού σφαιριδίου
Η εξασφάλιση ελάχιστης απώλειας του σφαιριδίου κυττάρων περιλαμβάνει προσεκτική πιπέτα και, εάν είναι απαραίτητο, πολλαπλούς γύρους φυγοκέντρησης και αφαίρεσης υπερκείμενων. Ο στόχος είναι να διατηρηθούν όσο το δυνατόν περισσότερα κύτταρα στο σφαιρίδιο για μέγιστη ανάκτηση DNA.
Προσθήκη διαλύματος λύσης πυρήνων
● Συστατικά του διαλύματος λύσης πυρήνων
Το διάλυμα λύσης πυρήνων περιέχει τυπικά ένα απορρυπαντικό (όπως το SDS), ένα ρυθμιστικό διάλυμα (όπως το Tris - HCl) και έναν χηλικό παράγοντα (όπως το EDTA). Το απορρυπαντικό διαταράσσει την κυτταρική μεμβράνη και τον πυρηνικό φάκελο, απελευθερώνοντας τα κυτταρικά περιεχόμενα, συμπεριλαμβανομένου του DNA, στο διάλυμα.
● Ρόλος στη διάσπαση των κυτταρικών τοιχωμάτων
Το διάλυμα λύσης πυρήνων όχι μόνο λύνει την κυτταρική μεμβράνη, αλλά επίσης μετουσώνει τις πρωτεΐνες και τα λιπίδια, καταρρέοντας αποτελεσματικά τα κυτταρικά τοιχώματα και τους πυρηνικούς φακέλους για να απελευθερώσουν το DNA στο διάλυμα.
Επαναιώριση κυττάρων
● απαλή πιπέτα για να αποφευχθεί η διάτμηση του DNA
Μόλις προστεθεί το διάλυμα λύσης πυρήνων, τα κύτταρα πρέπει να επαναιωρούνται απαλά για να αποφευχθεί η διάτμηση του DNA. Η διάτμηση μπορεί να σπάσει το DNA σε μικρότερα θραύσματα, τα οποία μπορεί να είναι προβληματικά για εφαρμογές κατάντη που απαιτούν υψηλό - μοριακό - DNA βάρους.
● Εξασφάλιση πλήρους επαναιώρησης
Η πλήρης επαναιώρηση εξασφαλίζει ότι όλα τα κύτταρα λύονται ομοιόμορφα, μεγιστοποιώντας την ανάκτηση του DNA. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με απαλή πιπέτα ή στροβιλισμό της λύσης με χαμηλή ταχύτητα.
Επώαση για να λυθεί κύτταρα
● Ρυθμίσεις θερμοκρασίας για επώαση
Τα επαναιωμένα κύτταρα επωάζονται σε συγκεκριμένη θερμοκρασία για να εξασφαλίσουν πλήρη λύση. Αυτό γίνεται συνήθως στους 37 ° C έως 55 ° C. Η ακριβής θερμοκρασία και διάρκεια μπορεί να ποικίλει ανάλογα με το πρωτόκολλο και τις ειδικές απαιτήσεις του χρησιμοποιούμενου κιτ απομόνωσης DNA.
● Διάρκεια που απαιτείται για αποτελεσματική λύση
Η τυπική διάρκεια για επώαση είναι μεταξύ 20 και 30 λεπτών, αλλά μπορεί να ρυθμιστεί με βάση την αποτελεσματικότητα της κυτταρικής λύσης που παρατηρείται. Η παρατεταμένη επώαση μπορεί να είναι απαραίτητη για πλήρη λύση, αλλά θα πρέπει να εξισορροπηθεί με τον κίνδυνο αποικοδόμησης του DNA.
Ψύξη σε θερμοκρασία δωματίου
● Σημασία σταδιακής ψύξης
Μετά την επώαση, το προϊόν λύσης ψύχεται σταδιακά σε θερμοκρασία δωματίου. Η σταδιακή ψύξη βοηθά στη σταθεροποίηση του DNA και ελαχιστοποιεί τον κίνδυνο θερμικού σοκ, ο οποίος θα μπορούσε ενδεχομένως να υποβαθμίσει το DNA.
● Επιδράσεις σε DNA και κυτταρικά συντρίμμια
Η ψύξη σε θερμοκρασία δωματίου επιτρέπει στα κυτταρικά υπολείμματα να καταβυθίζονται, καθιστώντας ευκολότερη τη διαχωρισμό του DNA στα επόμενα βήματα. Αυτό βοηθά επίσης στη σταθεροποίηση των ενζυμικών δραστηριοτήτων και διευκολύνει την απομάκρυνση του RNA με θεραπεία με RNase.
Προσθήκη διαλύματος RNase
● Σκοπός της RNase στη διαδικασία
Το διάλυμα RNase προστίθεται για να αποικοδομήσει το RNA, το οποίο διαφορετικά θα μπορούσε να καθαρίσει με το DNA και να παρεμβαίνει σε εφαρμογές κατάντη. Η RNase επιβεβαιώνει επιλεκτικά το RNA, αφήνοντας το DNA άθικτο.
● Πρόληψη της μόλυνσης του RNA
Η πρόληψη της μόλυνσης του RNA είναι ζωτικής σημασίας για εφαρμογές που απαιτούν καθαρό DNA, όπως η PCR και η αλληλουχία. Η θεραπεία με RNase εξασφαλίζει ότι το απομονωμένο DNA είναι απαλλαγμένο από ρύπους RNA.
Καθαρισμός του DNA
● Μέθοδοι για τον διαχωρισμό του DNA από άλλα κυτταρικά συστατικά
Αρκετές μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον καθαρισμό του DNA από το προϊόν λύσης. Αυτές περιλαμβάνουν εκχύλιση φαινόλης - χλωροφόρμιο, κατακρήμνιση αιθανόλης και χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ DNA E. coli. Κάθε μέθοδος έχει τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματά της, με εμπορικά κιτ που προσφέρουν ευκολία και συνεπή αποτελέσματα.
● Σκέψεις για καθαρότητα DNA
Η καθαρότητα είναι ένας κρίσιμος παράγοντας για την επιτυχία των εφαρμογών κατάντη. Τα εμπορικά κιτ, όπως το κιτ κυτταροθεραπείας Ε. Coli DNA, έχουν σχεδιαστεί για να αποδίδουν υψηλό ϋΝΑ καθαρότητας, αφαιρώντας αποτελεσματικά τις πρωτεΐνες, τα λιπίδια και άλλες μολυσματικές ουσίες.
Αποθήκευση και χειρισμός απομονωμένου DNA
● Βέλτιστες πρακτικές για την αποθήκευση του DNA
Μόλις καθαριστεί, το DNA θα πρέπει να αποθηκεύεται σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα, όπως το buffer TE, στους 20 ° C ή - 80 ° C για μακροχρόνια αποθήκευση. Αποφύγετε τη συχνή κατάψυξη - απόψυξη κύκλων καθώς μπορούν να προκαλέσουν αποικοδόμηση DNA.
● Διατήρηση ακεραιότητας DNA για εφαρμογές κατάντη
Για να διατηρηθεί η ακεραιότητα του DNA, χρησιμοποιήστε αποστειρωμένα, νουκλεάση - ελεύθεροι σωλήνες και διαλύματα. Αυτό εξασφαλίζει ότι το DNA παραμένει μη μολυσμένο και κατάλληλο για εφαρμογές όπως η κλωνοποίηση, η αλληλουχία και η PCR.
ΓιαΜπλεκιτς
Η Jiangsu Hillgene ίδρυσε την έδρα της (10.000 ㎡ GMP Plants and R & D Center) στη Suzhou, που βρίσκεται στην περιοχή Wuzhong, Suzhou, μια πόλη Lakeshore της όμορφης λίμνης Taihu και δύο κατασκευαστικές περιοχές στο Shenzhen και τη Σαγκάη, επεκτείνοντας το δίκτυο κατασκευής της σε εθνικό επίπεδο. Ο χώρος της Βόρειας Καρολίνας στις ΗΠΑ βρίσκεται υπό κατασκευή, διαδίδοντας περαιτέρω την παγκόσμια παρουσία της. Το Hillgene έχει δημιουργήσει μια ρητή οδό για την ανάπτυξη προϊόντων κυτταρικής θεραπείας, από την ανακάλυψη έως την παράδοση, με πλατφόρμες για την κατασκευή νουκλεϊκών οξέων, τον ορό - ελεύθερη καλλιέργεια ανάρτησης, την ανάπτυξη κλειστών διεργασιών και τη δοκιμή QC. Τα προϊόντα BlueKit έχουν σχεδιαστεί για ποιοτικό έλεγχο, εξασφαλίζοντας την επιτυχία των καινοτομιών κυτταρικής θεραπείας.
Χρόνος δημοσίευσης: 2024 - 09 - 05 14:47:03
