Isolering af DNA fra E. coli er en grundlæggende procedure i molekylærbiologi. Denne artikel vil lede dig gennem hele processen, give detaljerede trin og forklaringer, hvilket sikrer, at du forstår både videnskaben og de praktiske aspekter af proceduren. Uanset om du er en erfaren forsker eller en nykommer i laboratoriet, vil denne guide være en værdifuld ressource.
Forberedelse af cellesuspension
● Indsamling af E. coli -celler
Det første trin til isolering af DNA fra E. coli involverer opsamling af bakterieceller. Dette kræver normalt at vokse E. coli i et passende flydende medium, indtil det når den logaritmiske vækstfase. Timingen er afgørende, fordi celler i denne fase er mest levedygtige og lettere at lyse, hvilket vil resultere i højere DNA -udbytte.
● Resuspendige celler i en passende buffer
Indsamlede celler resuspenderes derefter i en passende buffer. Et almindeligt valg er en Tris - Edta (TE) -buffer, som hjælper med at bevare DNA'ets integritet under ekstraktionsprocessen. Bufferen tjener flere formål: den stabiliserer pH, chelates divalente kationer, som ellers kan forringe DNA, og giver et optimalt ionisk miljø for efterfølgende enzymatiske reaktioner.
Centrifugering til pelletceller
● Parametre til centrifugering (hastighed og tid)
Efter resuspendering af cellerne udsættes suspensionen for centrifugering for pelleten cellerne. Centrifugeringshastighed og tid er kritiske parametre. Typisk udføres centrifugering på ca. 4.000 - 6.000 g i 10 - 15 minutter ved 4 ° C. Dette sikrer, at cellerne danner en stram pellet i bunden af centrifugerøret.
● Betydningen af korrekt pelletering
Korrekt pelletering er vigtig for at adskille cellerne fra vækstmediet og andre opløselige komponenter. En brønd - dannet pellet gør de efterfølgende trin lettere og mere effektive, hvilket sikrer minimalt tab af celler og derfor maksimalt DNA -udbytte.
Fjernelse af supernatant
● Teknikker til fjernelse af supernatant
Når cellerne er pelleteret, skal supernatanten (væsken over pelleten) fjernes omhyggeligt uden at forstyrre cellepelleten. Dette gøres normalt ved hjælp af en mikropipette. Det er vigtigt at udføre dette trin omhyggeligt for at undgå at miste celler.
● Sikring af minimalt tab af cellepellet
At sikre minimalt tab af cellepelleten involverer omhyggelig pipettering og om nødvendigt flere runder med centrifugering og supernatantfjernelse. Målet er at opbevare så mange celler som muligt i pelleten for maksimal DNA -genvinding.
Tilføjelse af kernerlysopløsning
● Komponenter i kernerlysopløsning
Kernelysens opløsning indeholder typisk et vaskemiddel (som SDS), en buffer (såsom Tris - HCL) og et chelateringsmiddel (som EDTA). Detergenten forstyrrer cellemembranen og atomkonvolutten og frigiver det cellulære indhold, inklusive DNA, i opløsningen.
● rolle i nedbrydning af cellevægge
Kernelysens opløsning lyser ikke kun cellemembranen, men denaturerer også proteiner og lipider, hvilket effektivt nedbryder cellevæggene og nukleare konvolutter for at frigive DNA i opløsningen.
Resuspension af celler
● Blid pipettering for at undgå DNA -klipning
Når kernelysopløsningen er tilsat, skal cellerne være resuspenderet forsigtigt for at undgå DNA -klipning. Forskæring kan opdele DNA'et i mindre fragmenter, hvilket kan være problematisk til nedstrømsanvendelser, der kræver høj - molekylær - vægt -DNA.
● Sikring af fuldstændig resuspension
Komplet resuspension sikrer, at alle celler er lysede ensartet, hvilket maksimerer DNA -genvinding. Dette kan opnås ved blid pipettering eller hvirvlende opløsningen med en lav hastighed.
Inkubation til Lyse -celler
● Temperaturindstillinger til inkubation
De resuspenderede celler inkuberes ved en specifik temperatur for at sikre fuldstændig lysering. Dette gøres normalt ved 37 ° C til 55 ° C. Den nøjagtige temperatur og varighed kan variere afhængigt af protokollen og de specifikke krav i DNA -isoleringssættet, der anvendes.
● Varighed krævet til effektiv lysis
Den typiske varighed for inkubation er mellem 20 til 30 minutter, men den kan justeres baseret på effektiviteten af den observerede cellelysering. Langvarig inkubation kan være nødvendig for fuldstændig lysis, men bør afbalanceres mod risikoen for DNA -nedbrydning.
Afkøling til stuetemperatur
● Betydningen af gradvis afkøling
Efter inkubation afkøles lysatet gradvist til stuetemperatur. Gradvis afkøling hjælper med at stabilisere DNA'et og minimerer risikoen for termisk chok, som potentielt kan forringe DNA'et.
● Effekter på DNA og cellulært affald
Afkøling til stuetemperatur gør det muligt for det cellulære affald at udfælde, hvilket gør det lettere at adskille DNA'et i de efterfølgende trin. Dette hjælper også med at stabilisere enzymaktiviteterne og letter fjernelse af RNA ved RNase -behandling.
Tilføjelse af RNase -løsning
● Formål med RNase i proceduren
RNase -opløsning tilsættes for at nedbryde RNA, som ellers kunne co - rensning med DNA og forstyrre nedstrøms applikationer. RNase fordøjer selektivt RNA og efterlader DNA'et intakt.
● Forebyggelse af RNA -forurening
Forebyggelse af RNA -kontaminering er afgørende for anvendelser, der kræver rent DNA, såsom PCR og sekventering. RNase -behandlingen sikrer, at det isolerede DNA er fri for RNA -kontaminanter.
Oprensning af DNA
● Metoder til adskillelse af DNA fra andre cellulære komponenter
Flere metoder kan bruges til at rense DNA fra lysatet. Disse inkluderer phenol - chloroformekstraktion, ethanoludfældning og anvendelse af kommercielle E. coli -DNA -sæt. Hver metode har sine fordele og ulemper, med kommercielle sæt, der tilbyder bekvemmelighed og konsistente resultater.
● Overvejelser for DNA -renhed
Renhed er en kritisk faktor for succes med nedstrøms applikationer. Kommercielle sæt, såsom celleterapi E. coli DNA -kit, er designet til at give højt - renheds -DNA ved effektivt at fjerne proteiner, lipider og andre forurenende stoffer.
Opbevaring og håndtering af isoleret DNA
● Bedste praksis til opbevaring af DNA
Når den først er oprenset, skal DNA opbevares i en passende puffer, som TE -puffer, ved - 20 ° C eller - 80 ° C for lang - termopbevaring. Undgå hyppig frysning - optøningscyklusser, da de kan forårsage DNA -nedbrydning.
● Opretholdelse af DNA -integritet for nedstrøms applikationer
For at opretholde DNA -integritet skal du bruge steril, nuklease - Gratis rør og opløsninger. Dette sikrer, at DNA'et forbliver uforurenet og egnet til anvendelser såsom kloning, sekventering og PCR.
OmBluekit
Jiangsu Hillgene etablerede sit hovedkvarter (10.000 ㎡ GMP -planter og F & U -center) i Suzhou, der ligger i Wuzhong -distriktet, Suzhou, en Lakeshore -by i den smukke Taihu -sø, og to fremstillingssteder i Shenzhen og Shanghai, der strækker sin fremstillingsnetværk land. North Carolina -stedet i USA er i øjeblikket under opførelse og spreder sin globale tilstedeværelse yderligere. Hillgene har bygget en ekspressvej til udvikling af cellulære terapiprodukter, fra opdagelse til levering, med platforme til nukleinsyrefremstilling, serum - Gratis ophængningskultur, lukket procesudvikling og QC -test. BlueKit -produkter er designet til kvalitetskontrol, hvilket sikrer succes med cellulære terapiinnovationer.
Posttid: 2024 - 09 - 05 14:47:03
