Mae ynysu DNA oddi wrth E. coli yn weithdrefn sylfaenol mewn bioleg foleciwlaidd. Bydd yr erthygl hon yn eich tywys trwy'r broses gyfan, gan ddarparu camau ac esboniadau manwl, gan sicrhau eich bod yn deall gwyddoniaeth ac agweddau ymarferol y weithdrefn. P'un a ydych chi'n ymchwilydd profiadol neu'n newydd -ddyfodiad i'r labordy, bydd y canllaw hwn yn adnodd gwerthfawr.
Paratoi ataliad celloedd
● Casglu celloedd E. coli
Mae'r cam cyntaf wrth ynysu DNA oddi wrth E. coli yn cynnwys casglu'r celloedd bacteriol. Mae hyn fel arfer yn gofyn am dyfu E. coli mewn cyfrwng hylif addas nes ei fod yn cyrraedd y cyfnod twf logarithmig. Mae'r amseru yn hanfodol oherwydd bod celloedd yn y cam hwn yn fwyaf hyfyw ac yn haws eu lyse, a fydd yn arwain at gynnyrch DNA uwch.
● Ail -wario celloedd mewn byffer priodol
Yna mae celloedd a gasglwyd yn cael eu hail -wario mewn byffer addas. Dewis cyffredin yw byffer Tris - EDTA (TE), sy'n helpu i gynnal cyfanrwydd y DNA yn ystod y broses echdynnu. Mae'r byffer yn cyflawni sawl pwrpas: mae'n sefydlogi'r pH, yn chelates cations divalent a allai fel arall ddiraddio DNA, ac yn darparu amgylchedd ïonig gorau posibl ar gyfer adweithiau ensymatig dilynol.
Centrifugation i gelloedd pelenni
● Paramedrau ar gyfer centrifugio (cyflymder ac amser)
Ar ôl ail -wario'r celloedd, mae'r ataliad yn destun centrifugation i beledu’r celloedd. Mae cyflymder ac amser centrifugation yn baramedrau critigol. Yn nodweddiadol, mae centrifugio yn cael ei berfformio ar oddeutu 4,000 - 6,000 g am 10 - 15 munud ar 4 ° C. Mae hyn yn sicrhau bod y celloedd yn ffurfio pelen dynn ar waelod y tiwb centrifuge.
● Pwysigrwydd peledu cywir
Mae pelennu cywir yn hanfodol i wahanu'r celloedd oddi wrth y cyfrwng twf a chydrannau hydawdd eraill. Mae pelen wedi'i ffurfio ffynnon - yn gwneud y camau dilynol yn haws ac yn fwy effeithlon, gan sicrhau cyn lleied â phosibl o gelloedd ac, felly, y cynnyrch DNA mwyaf.
Tynnu uwchnatur
● Technegau ar gyfer tynnu uwchnatur
Ar ôl i'r celloedd gael eu peledu, rhaid tynnu'r uwchnatur (yr hylif uwchben y belen) yn ofalus heb darfu ar y belen gell. Gwneir hyn fel arfer gan ddefnyddio micropipette. Mae'n hanfodol perfformio'r cam hwn yn ofalus er mwyn osgoi colli unrhyw gelloedd.
● Sicrhau colli posibl o belen celloedd
Mae sicrhau lleiafswm o golled y belen gell yn cynnwys pibetio gofalus ac, os oes angen, rowndiau lluosog o centrifugio a thynnu uwchnatur. Y nod yw cadw cymaint o gelloedd â phosib yn y belen ar gyfer adferiad DNA uchaf.
Ychwanegu toddiant lysis niwclysau
● Cydrannau datrysiad lysis niwclysau
Mae'r datrysiad lysis niwclysau fel arfer yn cynnwys glanedydd (fel SDS), byffer (fel Tris - HCl), ac asiant chelating (fel EDTA). Mae'r glanedydd yn tarfu ar y gellbilen a'r amlen niwclear, gan ryddhau'r cynnwys cellog, gan gynnwys DNA, i'r toddiant.
● Rôl wrth chwalu waliau celloedd
Mae'r toddiant lysis niwclysau nid yn unig yn gorwedd y gellbilen cell ond hefyd yn dadnateiddio proteinau a lipidau, gan dorri i lawr y waliau celloedd ac amlenni niwclear i bob pwrpas i ryddhau DNA i'r toddiant.
Ail -osod celloedd
● Pibetio ysgafn er mwyn osgoi cneifio DNA
Unwaith y bydd yr hydoddiant lysis niwclysau yn cael ei ychwanegu, mae angen ail -wario'r celloedd yn ysgafn er mwyn osgoi cneifio DNA. Gall cneifio dorri'r DNA yn ddarnau llai, a all fod yn broblem ar gyfer cymwysiadau i lawr yr afon sy'n gofyn am DNA uchel - moleciwlaidd - pwysau.
● Sicrhau ail -ymgynnull llwyr
Mae ail -osod cyflawn yn sicrhau bod yr holl gelloedd yn cael eu gorchuddio'n unffurf, gan wneud y mwyaf o adferiad DNA. Gellir cyflawni hyn trwy bibetio ysgafn neu fortecsio'r toddiant ar gyflymder isel.
Deori i gelloedd lyse
● Gosodiadau tymheredd ar gyfer deori
Mae'r celloedd sydd wedi'u hail -wario yn cael eu deori ar dymheredd penodol i sicrhau lysis cyflawn. Gwneir hyn fel arfer ar 37 ° C i 55 ° C. Gall yr union dymheredd a hyd amrywio yn dibynnu ar y protocol a gofynion penodol y pecyn ynysu DNA sy'n cael ei ddefnyddio.
● Hyd yn ofynnol ar gyfer lysis effeithiol
Mae'r hyd nodweddiadol ar gyfer deori rhwng 20 a 30 munud, ond gellir ei addasu yn seiliedig ar effeithlonrwydd lysis celloedd a arsylwyd. Efallai y bydd angen deori hir ar gyfer lysis cyflawn ond dylid ei gydbwyso yn erbyn y risg o ddiraddio DNA.
Oeri i dymheredd yr ystafell
● Pwysigrwydd oeri graddol
Ar ôl y deori, mae'r lysate yn cael ei oeri yn raddol i dymheredd yr ystafell. Mae oeri graddol yn helpu i sefydlogi'r DNA a lleihau'r risg o sioc thermol, a allai o bosibl ddiraddio'r DNA.
● Effeithiau ar DNA a malurion cellog
Mae oeri i dymheredd yr ystafell yn caniatáu i'r malurion cellog waddodi, gan ei gwneud hi'n haws gwahanu'r DNA yn y camau dilynol. Mae hyn hefyd yn helpu i sefydlogi'r gweithgareddau ensymau ac yn hwyluso cael gwared ar RNA trwy driniaeth RNase.
Ychwanegu Datrysiad RNase
● Pwrpas RNase yn y weithdrefn
Ychwanegir toddiant RNase i ddiraddio RNA, a allai fel arall gyd -fynd â'r DNA ac ymyrryd â chymwysiadau i lawr yr afon. Mae RNase yn treulio RNA yn ddetholus, gan adael y DNA yn gyfan.
● Atal halogi RNA
Mae atal halogiad RNA yn hanfodol ar gyfer cymwysiadau sy'n gofyn am DNA pur, fel PCR a dilyniant. Mae'r driniaeth RNase yn sicrhau bod y DNA ynysig yn rhydd o halogion RNA.
Puro DNA
● Dulliau ar gyfer gwahanu DNA oddi wrth gydrannau cellog eraill
Gellir defnyddio sawl dull i buro DNA o'r lysate. Mae'r rhain yn cynnwys ffenol - echdynnu clorofform, dyodiad ethanol, a defnyddio citiau DNA E. coli masnachol. Mae gan bob dull ei fanteision a'i anfanteision, gyda chitiau masnachol yn cynnig cyfleustra a chanlyniadau cyson.
● Ystyriaethau ar gyfer purdeb DNA
Mae purdeb yn ffactor hanfodol ar gyfer llwyddiant ceisiadau i lawr yr afon. Mae citiau masnachol, fel y therapi celloedd E. coli DNA cit, wedi'u cynllunio i gynhyrchu DNA purdeb uchel - purdeb trwy dynnu proteinau, lipidau a halogion eraill yn effeithiol.
Storio a thrafod DNA ynysig
● Arferion gorau ar gyfer storio DNA
Ar ôl ei buro, dylid storio DNA mewn byffer addas, fel byffer TE, ar - 20 ° C neu - 80 ° C ar gyfer storio hir - tymor. Osgoi rhewi'n aml - Toddi cylchoedd oherwydd gallant achosi diraddiad DNA.
● Cynnal cyfanrwydd DNA ar gyfer cymwysiadau i lawr yr afon
I gynnal cyfanrwydd DNA, defnyddiwch di -haint, nuclease - tiwbiau ac atebion am ddim. Mae hyn yn sicrhau bod y DNA yn parhau i fod heb ei halogi ac yn addas ar gyfer ceisiadau fel clonio, dilyniannu a PCR.
Yn ymwneudBluekit
Sefydlodd Jiangsu Hillgene ei bencadlys (10,000㎡ o blanhigion GMP a chanolfan Ymchwil a Datblygu) yn Suzhou, a leolir yn ardal Wuzhong, Suzhou, dinas llyn yn llyn hardd Taihu, a dau safle gweithgynhyrchu yn Shenzhen a Shanghai, gan ymestyn ei rhwydwaith gweithgynhyrchu, yn ymestyn ei rhwydwaith gweithgynhyrchu. Mae safle Gogledd Carolina yn yr UD yn cael ei adeiladu ar hyn o bryd, gan ledaenu ei bresenoldeb byd -eang ymhellach. Mae Hillgene wedi adeiladu llwybr penodol ar gyfer datblygu cynhyrchion therapi cellog, o ddarganfod i ddanfon, gyda llwyfannau ar gyfer gweithgynhyrchu asid niwclëig, serwm - diwyllio ataliad am ddim, datblygu prosesau caeedig, a phrofion QC. Mae cynhyrchion Bluekit wedi'u cynllunio ar gyfer rheoli ansawdd, gan sicrhau llwyddiant arloesiadau therapi cellog.
Amser Post: 2024 - 09 - 05 14:47:03
