Izolační DNA z E. coli je základní postup v molekulární biologii. Tento článek vás projde celým procesem, poskytne podrobné kroky a vysvětlení a zajistí, abyste pochopili vědu i praktické aspekty postupu. Ať už jste zkušeným výzkumníkem nebo nováčkem v laboratoři, bude tato příručka cenným zdrojem.
Příprava buněčné suspenze
● Sběr buněk E. coli
První krok při izolaci DNA z E. coli zahrnuje sběr bakteriálních buněk. To obvykle vyžaduje pěstování E. coli ve vhodném kapalném médiu, dokud nedosáhne logaritmické růstové fáze. Načasování je zásadní, protože buňky v této fázi jsou nejsilnější a snadnější lyzovat, což povede k vyššímu výnosu DNA.
● Resuspending buňky ve vhodném pufru
Shromážděné buňky se poté resuspendují ve vhodném pufru. Běžnou volbou je vyrovnávací paměť Tris - EDTA (TE), která pomáhá udržovat integritu DNA během procesu extrakce. Pufr slouží více účelům: stabilizuje pH, cheláty dvojmocné kationty, které by jinak mohly degradovat DNA, a poskytuje optimální iontové prostředí pro následné enzymatické reakce.
Centrifugace na peletové buňky
● Parametry pro centrifugace (rychlost a čas)
Po resuspenzi buněk je suspenze podrobena centrifugaci na peletu buněk. Rychlost a čas odstředění jsou kritické parametry. Obvykle se centrifugace provádí při přibližně 4 000 - 6 000 g po dobu 10 - 15 minut při 4 ° C. Tím je zajištěno, že buňky tvoří těsnou peletu ve spodní části odstředivé trubice.
● Důležitost správného peletingu
Správné pelety je nezbytné pro oddělení buněk od růstového média a dalších rozpustných složek. Stulá - vytvořená peleta usnadňuje a efektivnější a zajišťuje minimální ztrátu buněk, a proto je maximální výnos DNA.
Odstranění supernatantu
● Techniky odstranění supernatantů
Jakmile jsou buňky peletovány, musí být supernatant (kapalina nad peletou) pečlivě odstraněna bez narušení buněčné pelety. To se obvykle provádí pomocí mikropipety. Je zásadní provádět tento krok pečlivě, aby se zabránilo ztrátě jakýchkoli buněk.
● Zajištění minimální ztráty pelety buněk
Zajištění minimální ztráty buněčné pelety zahrnuje pečlivé pipety a v případě potřeby více kol odstředění a odstranění supernatantu. Cílem je udržet co nejvíce buněk v peletě pro maximální zotavení DNA.
Přidání řešení jádra lýzy
● Složky roztoku lýzy jádra
Roztok lýzy jádra obvykle obsahuje detergent (jako SDS), pufr (jako je Tris - HC1) a chelatační činidlo (jako EDTA). Detergennt narušuje buněčnou membránu a jadernou obálku a uvolní buněčný obsah, včetně DNA, do roztoku.
● Role při rozbíjení buněčných stěn
Roztok lýzy jádra nejen lyzí buněčnou membránu, ale také denaturuje proteiny a lipidy, což účinně rozkládá buněčné stěny a jaderné obálky, aby se uvolnila DNA do roztoku.
Resuspenze buněk
● Jemné pipety, aby se zabránilo smyčce DNA
Jakmile je přidán roztok jádra lýzy, musí být buňky resuspendovány jemně resuspendovány, aby se zabránilo střihu DNA. Střih může rozdělit DNA na menší fragmenty, které mohou být problematické pro následné aplikace, které vyžadují vysokou molekulární - hmotnost DNA.
● Zajištění úplného obnovení
Úplná resuspenze zajišťuje, že všechny buňky jsou rovnoměrně lyžovány a maximalizují regeneraci DNA. Toho lze dosáhnout jemným pipettingem nebo vírem roztoku při nízké rychlosti.
Inkubace na lyse buňky
● Nastavení teploty pro inkubaci
Resuspendované buňky jsou inkubovány při specifické teplotě, aby byla zajištěna úplná lýza. To se obvykle provádí při 37 ° C až 55 ° C. Přesná teplota a doba trvání se může lišit v závislosti na protokolu a specifických požadavcích použité soupravy izolace DNA.
● Doba trvání potřebná pro efektivní lýzu
Typická doba trvání inkubace je mezi 20 až 30 minutami, ale může být upravena na základě účinnosti pozorované buněčné lýzy. Pro úplnou lýzu může být nezbytná prodloužená inkubace, ale měla by být vyvážena s rizikem degradace DNA.
Chlazení na teplotu pokoje
● Důležitost postupného chlazení
Po inkubaci je lyzát postupně ochlazován na teplotu místnosti. Postupné chlazení pomáhá při stabilizaci DNA a minimalizuje riziko tepelného šoku, což by mohlo potenciálně degradovat DNA.
● Účinky na DNA a buněčné zbytky
Chlazení na pokojovou teplotu umožňuje srážení buněčných zbytků, což usnadňuje oddělení DNA v následujících krocích. To také pomáhá stabilizovat enzymatické aktivity a usnadňuje odstranění RNA ošetřením RNA.
Přidání roztoku RNázy
● Účel RNázy v postupu
Roztok RNázy je přidán pro degradaci RNA, která by jinak mohla být čistěna s DNA a interferovat s následné aplikace. RNáza selektivně tráví RNA, takže DNA ponechává neporušenou DNA.
● Prevence kontaminace RNA
Prevence kontaminace RNA je zásadní pro aplikace, které vyžadují čistou DNA, jako je PCR a sekvenování. Ošetření RNázy zajišťuje, že izolovaná DNA je bez kontaminantů RNA.
Čištění DNA
● Metody oddělení DNA od jiných buněčných složek
K čištění DNA z lyzátu lze použít několik metod. Patří mezi ně fenol - extrakce chloroformu, srážení ethanolu a použití komerčních souprav DNA E. coli. Každá metoda má své výhody a nevýhody, s komerčními soupravami nabízejícími pohodlí a konzistentní výsledky.
● Úvahy o čistotě DNA
Čistota je kritickým faktorem úspěchu následných aplikací. Komerční soupravy, jako je buněčná terapie E. coli DNA souprava, jsou navrženy tak, aby poskytovaly vysokou čistotu DNA účinným odstraněním proteinů, lipidů a dalších kontaminantů.
Skladování a manipulace s izolovanou DNA
● Osvědčené postupy pro ukládání DNA
Po očištění by měla být DNA uložena ve vhodném vyrovnávací paměti, jako je TE pufr, při - 20 ° C nebo - 80 ° C pro dlouhodobé skladování. Vyvarujte se častého zmrazení - cyklu tání, protože mohou způsobit degradaci DNA.
● Udržování integrity DNA pro následné aplikace
Chcete -li udržovat integritu DNA, použijte sterilní, nukleázu - zdarma trubice a roztoky. Tím je zajištěno, že DNA zůstává nekontaminovaná a vhodná pro aplikace, jako je klonování, sekvenování a PCR.
OBluekit
Jiangsu Hillgene zřídila své ústředí (10 000 ° GMP rostlin a výzkumné a vývojové centrum) v Suzhou, která se nachází v okrese Wuzhong, Suzhou, jezerní město krásného taihu jezera a dvě výrobní místa v Shenzhenu a Šanghaji. Místo Severní Karolíny v USA je v současné době ve výstavbě a dále šíří svou globální přítomnost. Hillgene vybudovala expresní cestu pro vývoj produktů buněčné terapie, od objevování po dodávku, s platformami pro výrobu nukleových kyselin, séra - kultivace volné suspenze, vývoj uzavřeného procesu a testování QC. Produkty Bluekit jsou určeny pro kontrolu kvality, což zajišťuje úspěch inovací buněčné terapie.
Čas příspěvku: 2024 - 09 - 05 14:47:03
