Ang pag-inusara sa DNA gikan sa E. Coli usa ka sukaranan nga pamaagi sa molekular nga biology. Kini nga artikulo maglakaw kanimo sa tibuuk nga proseso, nga naghatag detalyado nga mga lakang ug mga pagpatin-aw, pagsiguro nga imong masabtan ang siyensya ug ang praktikal nga mga bahin sa pamaagi. Kung ikaw usa ka batid nga tigdukiduki o usa ka bag-o sa lab, kini nga giya usa ka bililhon nga kapanguhaan.
Pagpangandam sa cell suspension
● Koleksyon sa E. Coli Cells
Ang una nga lakang sa pag-inusara sa DNA gikan sa E. Coli naglangkit sa pagkolekta sa mga selula sa bakterya. Kasagaran kini nanginahanglan nga motubo nga E. Coli sa usa ka angay nga likido nga medium hangtod nga maabot ang litrato sa pagtubo sa logarithmic. Hinungdanon ang oras tungod kay ang mga selyula sa kini nga hugna mao ang labing mahimo ug mas dali sa lyse, nga moresulta sa mas taas nga ani sa DNA.
● Pagdili sa mga selyula sa usa ka angay nga buffer
Ang mga nakolekta nga mga selyula dayon resuspended sa usa ka angay nga buffer. Ang usa ka sagad nga kapilian mao ang usa ka tris - edta (te) buffer, nga makatabang sa pagpadayon sa integridad sa DNA sa proseso sa pagkuha. The buffer serves multiple purposes: it stabilizes the pH, chelates divalent cations which could otherwise degrade DNA, and provides an optimal ionic environment for subsequent enzymatic reactions.
Centrifugation sa mga selula sa pellet
● Mga parameter alang sa centrifugation (katulin ug oras)
Pagkahuman sa pagdili sa mga selyula, ang suspensyon gipailalom sa sentripolasyon sa pagsulud sa mga selyula. Ang katulin sa centrifugation ug oras mga kritikal nga mga parameter. Kasagaran, ang sentripugasyon gihimo sa mga 4,000 - 6,000 g alang sa 10 - 15 minuto sa 4 ° C. Gisiguro niini nga ang mga cell nagporma usa ka higpit nga pellet sa ilawom sa centrifuge tube.
● Kamahinungdanon sa Tukma nga Pelleting
Ang husto nga pelleting hinungdanon aron mabulag ang mga selyula gikan sa medium nga pagtubo ug uban pang mga sangkap nga masulbad. Usa ka atabay - Naporma nga Pellet ang naghimo sa mga sunud-sunod nga mga lakang nga mas dali ug labi ka episyente, pagsiguro sa gamay nga pagkawala sa mga selyula ug, busa, maximum nga ani sa DNA.
Pagtangtang sa supernatant
● Mga teknik alang sa supernatant nga pagtangtang
Sa higayon nga ang mga selyula gikulbaan, ang supernatant (ang likido sa ibabaw sa pellet) kinahanglan nga pag-amping nga tangtangon nga wala makabalda sa cell pellet. Kasagaran kini gihimo gamit ang usa ka mikropipette. Kini hinungdanon aron mahimo kini nga lakang nga mabinantayon nga maglikay sa pagkawala sa bisan unsang mga selyula.
● Pagsiguro sa gamay nga pagkawala sa Cell Plellet
Ang pagsiguro sa gamay nga pagkawala sa cell Plellet naglangkit sa mabinantayon nga pipetting ug, kung kinahanglan, daghang mga hugna sa centrifugation ug supernatant pagtangtang. Ang katuyoan mao ang pagpadayon sa daghang mga selyula kutob sa mahimo sa pellet alang sa labing taas nga pagbawi sa DNA.
Pagdugang sa solusyon sa nuclei lysis
● Mga sangkap sa solusyon sa lysis sa nuclei
Ang solusyon sa nuclei lysis sa kasagaran naglangkob sa usa ka sungkod (sama sa SDS), usa ka buffer (sama sa Trisk - HCL), ug usa ka cheelating ahente (sama sa EDTA). Ang SOVAGTER nakaguba sa cell membrane ug nukleyar nga sobre, gipagawas ang mga sulud sa cellular, lakip ang DNA, sa solusyon.
● Papel sa pagbungkag sa mga dingding sa cell
Ang solusyon sa nuclei nga lysis dili lamang nga naglihok sa selyula sa cell apan usab denaturizize sa mga protina ug mga lipid, epektibo nga pagbungkag sa mga cell wall ug nukleyar nga mga sobre ug nukleyar nga mga sobre ug nukleyar nga mga sobre ug nukleyar nga mga sobre ug nukleyar nga mga sobre ug nukleyar nga mga sobre ug nukleyar nga mga sobre ug nukleyar nga mga sobre ug nukleyar nga mga sobre ug nukleyar nga mga sobre ug nukleyar nga mga sobre ug nukleyar nga mga sobre ug nukleyar nga mga sobre ug nukleyar nga mga sobre ug nukleyar nga mga sobre ug nukleyar nga mga sobre ug nukleyar nga mga sobre aron ipagawas ang DNA.
Resuspension sa mga selyula
● Malumo nga pipetting aron malikayan ang pag-alima sa DNA
Sa diha nga ang solusyon sa lysis sa nuclei gidugang, ang mga selyula kinahanglan nga i-resuspendded sa hinay aron malikayan ang pag-alima sa DNA. Ang pag-alima mahimong makaguba sa DNA sa gagmay nga mga tipik, nga mahimong problema alang sa mga aplikasyon sa pag-abut nga nanginahanglan taas - Molus - Timbang DNA.
● Pagsiguro sa kompleto nga resuspension
Gisiguro sa kompleto nga resuspensension nga ang tanan nga mga selyula gihatud sa uniporme, pag-maximize ang pagkaayo sa DNA. Mahimo kini makab-ot sa malumo nga pipetting o pag-vortox sa solusyon sa usa ka gamay nga tulin.
Paglakip sa mga selyula sa Lyse
● Mga setting sa temperatura alang sa paglumlum
Ang mga resibo nga mga selyula nahumok sa usa ka piho nga temperatura aron masiguro ang kompleto nga lysis. Kasagaran kini gihimo sa 37 ° C hangtod 55 ° C. Ang eksakto nga temperatura ug gidugayon mahimong magkalainlain depende sa protocol ug ang piho nga mga kinahanglanon sa pagkolekta sa DNA nga gigamit.
● Ang gidugayon nga gikinahanglan alang sa epektibo nga lysis
Ang tipikal nga gidugayon alang sa paglumlum sa taliwala sa 20 hangtod 30 minuto, apan mahimo kini mabag-o base sa pagkaayo sa cell lysis naobserbahan. Ang malungtaron nga paglupig mahimong kinahanglanon alang sa kompleto nga lysis apan kinahanglan nga balanse sa peligro sa DNA Disegasyon.
Pag-cool sa temperatura sa kwarto
● Kahinungdanon sa anam-anam nga pagpabugnaw
Pagkahuman sa paglumlum, ang Lysate anam-anam nga gipabugnaw sa temperatura sa kwarto. Ang anam-anam nga mga tabang sa pagpabugnaw sa pag-ayo sa DNA ug gipamubu ang risgo sa thermal shock, nga mahimo'g mapugngan ang DNA.
● Mga epekto sa DNA ug Cellular Debris
Ang pagpabugnaw sa temperatura sa kwarto nagtugot sa mga cellular debris sa pag-ayo, nga labi ka dali nga magbulag sa DNA sa mga sunod nga mga lakang. Nakatabang usab kini aron mapalig-on ang mga kalihokan sa enzyme ug gipadali ang pagtangtang sa RNA pinaagi sa pagtambal sa rnase.
Pagdugang sa solusyon sa rnase
● Katuyoan sa rnase sa pamaagi
Ang solusyon sa RNASE gidugang aron mapanghimatuud ang RNA, nga kung dili kung ang CO - Limpyohan sa DNA ug makabalda sa mga aplikasyon sa pag-ulan. RNASE PEPPLIVIED DIGESSS RNA, gibiyaan ang DNA Intact.
● Paglikay sa kontaminasyon sa RNA
Ang paglikay sa kontaminasyon sa RNA hinungdanon alang sa mga aplikasyon nga nanginahanglan putli nga DNA, sama sa PCR ug kini nga pagkasunud. Gisiguro sa pagtambal sa rnase nga ang hilit nga DNA libre gikan sa mga kontaminado sa RNA.
Pagputli sa DNA
● Mga pamaagi alang sa pagbulag sa DNA gikan sa ubang mga sangkap sa cellular
Daghang mga pamaagi mahimong magamit aron malimpyohan ang DNA gikan sa Lysate. Lakip niini ang Phenol - Pag-agay sa chloroform, pag-ulan sa ethanol, ug paggamit sa komersyal nga E. Coli DNA Kits. Ang matag pamaagi adunay mga kaayohan niini ug kahusay, nga adunay komersyal nga mga kit nga nagtanyag sa kasayon nga gitanyag ug makanunayon nga mga sangputanan.
● Mga konsiderasyon alang sa DNA Putority
Ang kaputli usa ka kritikal nga hinungdan alang sa kalampusan sa mga aplikasyon sa pag-ubos. Ang mga Komersyal nga Kits, sama sa Cell Therapy E. Coli DNA Kit, gilaraw aron makahatag taas - kaputli DNA pinaagi sa epektibo nga pagtangtang sa mga protina, lipid, ug uban pang mga kontaminado.
Pagtipig ug pagdumala sa hilit nga DNA
● Labing maayo nga mga batasan alang sa pagtipig sa DNA
Sa higayon nga gihinloan, ang DNA kinahanglan nga gitipig sa usa ka angay nga buffer, sama sa buffer, sa - 20 ° C o - 8 ° C alang sa taas - term nga pagtipig. Paglikay sa kanunay nga pag-freeze - Tuga nga mga siklo nga mahimo nila nga hinungdan sa pagkadaut sa DNA.
● Pagpadayon sa integridad sa DNA alang sa mga aplikasyon sa Downstream
Aron mahuptan ang integridad sa DNA, gamita ang sterile, nuclease - libre nga mga tubo ug solusyon. Gisiguro niini nga ang DNA nagpabilin nga wala maabut ug angay alang sa mga aplikasyon sama sa pag-clone, sunud-sunod, ug PCR.
Labot saBlowekit
Gitukod ni Jiangsu Hillgene ang ulohan niini (10,000㎡ GMP Plants ug R & D Center) sa Suzhou, Suzhore Dis sa Shenzhen ug Shanghai niini sa tibuuk nasud. Ang North Carolina Site sa US karon gitukod, dugang nga nagpakaylap sa kalibutan nga presensya. Nagtukod si Blabgene og usa ka ekspresyon nga agianan alang sa pagpalambo sa mga produkto sa cellular therapy, gikan sa pagdiskubre, nga adunay mga platform sa nucleic acid, Serum nga pag-uswag sa proseso, ug pagsulay sa proseso. Ang mga produkto sa BlueKit gidisenyo alang sa pagpugong sa kalidad, pagsiguro sa kalampusan sa mga kabag-ohan sa cellular therapy.
Post Oras: 2024 - 09 - 05 14:47:03
