L’aïllament de l’ADN de E. coli és un procediment fonamental en la biologia molecular. Aquest article us dirigirà tot el procés, proporcionant passos i explicacions detallades, garantint que entengueu tant la ciència com els aspectes pràctics del procediment. Tant si sou un investigador experimentat com un nouvingut al laboratori, aquesta guia serà un recurs valuós.
Preparació de la suspensió cel·lular
● Recollida de cèl·lules de E. coli
El primer pas per aïllar l'ADN de E. coli consisteix en recollir les cèl·lules bacterianes. Normalment requereix créixer E. coli en un medi líquid adequat fins que arribi a la fase de creixement logarítmic. El temps és crucial perquè les cèl·lules d’aquesta fase són més viables i més fàcils de lisar, cosa que donarà lloc a un rendiment més elevat d’ADN.
● Les cèl·lules de reanimació en un buffer adequat
Les cèl·lules recollides es tornen a suspendre en un buffer adequat. Una elecció comuna és un buffer Tris - EDTA (TE), que ajuda a mantenir la integritat de l'ADN durant el procés d'extracció. El buffer serveix per a múltiples finalitats: estabilitza el pH, els quelats cations divalents que d’altra manera podrien degradar l’ADN i proporciona un entorn iònic òptim per a reaccions enzimàtiques posteriors.
Centrifugació a les cèl·lules de pellet
● Paràmetres per a la centrifugació (velocitat i temps)
Després de reanimar les cèl·lules, la suspensió està sotmesa a centrifugació per pellet les cèl·lules. La velocitat i el temps de centrifugació són paràmetres crítics. Normalment, la centrifugació es realitza al voltant de 4.000 - 6.000 g durant 10 - 15 minuts a 4 ° C. D’aquesta manera es garanteix que les cèl·lules formen un pellet estret a la part inferior del tub de centrífuga.
● Importància de la pellet adequada
La pelletada adequada és essencial per separar les cèl·lules del medi de creixement i altres components solubles. Un pellet ben format fa que els passos posteriors siguin més fàcils i eficients, garantint una pèrdua mínima de cèl·lules i, per tant, el màxim rendiment d’ADN.
Eliminació del sobrenedant
● Tècniques d'eliminació de sobrenedant
Una vegada que les cèl·lules siguin pelletades, el sobrenedant (el líquid per sobre del pellet) s’ha d’eliminar amb cura sense molestar el pellet de la cèl·lula. Normalment es fa mitjançant una micropipeta. És crucial realitzar aquest pas minuciosament per evitar perdre cap cèl·lula.
● Garantir una pèrdua mínima de pellet cel·lular
Garantir una pèrdua mínima del pellet de la cèl·lula implica una pipeta acurada i, si cal, múltiples rondes de centrifugació i eliminació de sobrenedants. L’objectiu és mantenir el màxim de cèl·lules possibles al pellet per a la recuperació màxima d’ADN.
Addició de solució de lisi de nuclis
● Components de la solució de nuclis
La solució de lisi nucli conté normalment un detergent (com SDS), un buffer (com Tris - HCl) i un agent quelant (com EDTA). El detergent pertorba la membrana cel·lular i l’embolcall nuclear, alliberant el contingut cel·lular, inclòs l’ADN, a la solució.
● Paper en el desglossament de les parets cel·lulars
La solució de nuclis no només lises la membrana cel·lular, sinó que desnaturalitza proteïnes i lípids, desglossant eficaçment les parets cel·lulars i els sobres nuclears per alliberar l'ADN a la solució.
Resuspensió de les cèl·lules
● Pipetting suau per evitar la cisalla d'ADN
Un cop afegida la solució de lisi de nuclis, cal tornar a suspendre les cèl·lules per evitar la cisalla de l'ADN. La cisalla pot trencar l’ADN en fragments més petits, cosa que pot ser problemàtica per a aplicacions aigües avall que requereixen un ADN de pes - molecular d’alçada.
● Garantir la reanimació completa
La reanimació completa garanteix que totes les cèl·lules són lisades uniformement, maximitzant la recuperació de l'ADN. Això es pot aconseguir mitjançant la canalització suau o vortexant la solució a una velocitat baixa.
Incubació a les cèl·lules de Lyse
● Configuració de temperatura per a la incubació
Les cèl·lules reanimades s’incuben a una temperatura específica per assegurar la lisi completa. Això es fa generalment a 37 ° C a 55 ° C. La temperatura i la durada exactes poden variar en funció del protocol i dels requisits específics del kit d’aïllament d’ADN que s’utilitza.
● Durada necessària per a la lisi efectiva
La durada típica de la incubació és d’entre 20 i 30 minuts, però es pot ajustar en funció de l’eficiència de la lisi cel·lular observada. La incubació prolongada pot ser necessària per a la lisi completa, però s’ha d’equilibrar contra el risc de degradació de l’ADN.
Refredament a temperatura ambient
● Importància del refredament gradual
Després de la incubació, el lisat es refreda gradualment a temperatura ambient. El refredament gradual ajuda a estabilitzar l’ADN i minimitza el risc de xoc tèrmic, cosa que podria degradar l’ADN.
● Efectes sobre l'ADN i les deixalles cel·lulars
El refredament a la temperatura ambient permet precipitar les deixalles cel·lulars, facilitant la separació de l'ADN en els passos posteriors. Això també ajuda a estabilitzar les activitats enzimàtiques i facilita l’eliminació de l’ARN mitjançant tractament amb RNase.
Addició de solució RNase
● Finalitat de la RNase en el procediment
La solució RNase s’afegeix a l’ARN degradat, que d’altra manera es podria purificar amb l’ADN i interferir amb les aplicacions aigües avall. La RNase digereix selectivament l’ARN, deixant l’ADN intacte.
● Prevenir la contaminació per l'ARN
La prevenció de la contaminació per l’ARN és crucial per a aplicacions que requereixen ADN pur, com la PCR i la seqüenciació. El tractament amb RNase garanteix que l’ADN aïllat estigui lliure de contaminants d’ARN.
Purificació de l'ADN
● Mètodes per separar l'ADN d'altres components cel·lulars
Es poden utilitzar diversos mètodes per purificar l'ADN del lisat. Aquests inclouen l'extracció de fenol - cloroform, precipitació d'etanol i l'ús de kits d'ADN de E. coli comercials. Cada mètode té els seus avantatges i contres, amb kits comercials que ofereixen comoditat i resultats consistents.
● Consideracions per a la puresa de l'ADN
La puresa és un factor crític per a l’èxit de les aplicacions aigües avall. Els kits comercials, com el kit d’ADN de la teràpia cel·lular E. coli, estan dissenyats per produir ADN d’alta puresa mitjançant eliminació de proteïnes, lípids i altres contaminants.
Emmagatzematge i manipulació d’ADN aïllat
● Les bones pràctiques per emmagatzemar ADN
Un cop purificat, l’ADN s’ha d’emmagatzemar en un buffer adequat, com el tampó TE, a - 20 ° C o - 80 ° C per a l’emmagatzematge de llarg termini. Eviteu la congelació freqüent - Thaw Cycles, ja que poden causar degradació de l'ADN.
● Mantenir la integritat de l'ADN per a aplicacions aigües avall
Per mantenir la integritat de l'ADN, utilitzeu tubs i solucions estèrils i nucleases - D’aquesta manera es garanteix que l’ADN es mantingui incontaminat i adequat per a aplicacions com la clonació, la seqüenciació i la PCR.
Al voltant deBluekit
Jiangsu Hillgene va establir la seva seu (10.000 ㎡ plantes GMP i Centre de R + D) a Suzhou, situada al districte de Wuzhong, Suzhou, una ciutat de Lakeshore del bonic llac Taihu i dos llocs de fabricació a Shenzhen i Xangai, que extensen la seva xarxa de fabricació a tot el país. Actualment, el lloc de Carolina del Nord als Estats Units està en construcció, estenent encara més la seva presència global. Hillgene ha construït una via expressa per desenvolupar productes de teràpia cel·lular, des del descobriment fins al lliurament, amb plataformes per a la fabricació d’àcids nucleics, cultiu de suspensions lliures de sèrum, desenvolupament de processos tancats i proves de QC. Els productes Bluekit estan dissenyats per al control de qualitat, garantint l’èxit de les innovacions de teràpia cel·lular.
Hora del missatge: 2024 - 09 - 05 14:47:03
