Izoliranje DNK iz E. COLI je temeljni postupak molekularne biologije. Ovaj članak će vas prošetati kroz cjelokupni proces, pružajući detaljne korake i objašnjenja, osiguravajući da razumijete i nauku i praktične aspekte postupka. Bez obzira da li ste začinjeni istraživač ili pridošlica u laboratoriji, ovaj vodič će biti vrijedan resurs.
Priprema ćelijskog ovjesa
● Prikupljanje E. Coli ćelija
Prvi korak u izolaciji DNK iz E. Coli uključuje prikupljanje bakterijskih ćelija. To obično zahtijeva da raste E. COLI u odgovarajućem tečnom mediju dok ne dosegne fazu logaritamskog rasta. Vreme je presudno jer su ćelije u ovoj fazi najnevjerovatnije i lakše lise, što će rezultirati većim prinosom DNK.
● Resuspendirajuće ćelije u odgovarajućem tamponku
Sakupljene ćelije se zatim resuspendiraju u odgovarajućem međuspremniku. Uobičajeni izbor je tampon Tris - EDTA (TE), koji pomaže u održavanju integriteta DNK tokom procesa ekstrakcije. Buffer služi višestruke svrhe: stabilizira pH, helate divalentne katije koje bi inače mogle razgraditi DNK i pruža optimalno jonsko okruženje za naredne enzimske reakcije.
Centrifugiranje ćelijama peleta
● Parametri za centrifugiranje (brzina i vreme)
Nakon resuspendiranja ćelija, suspenzija je izložena centrifugiranju za pelete ćelije. Brzina i vrijeme centrifugiranja su kritični parametri. Tipično se centrifugiranje izvodi na oko 4.000 - 6.000 g za 10 - 15 minuta na 4 ° C. To osigurava da ćelije formiraju uska peleta na dnu cijevi centrifuge.
● Važnost pravilnog peletiranja
Pravilno peletiranje je neophodno za odvajanje ćelija iz srednjih rasta i drugih topivih komponenti. Oštećeni pelet čini da sljedeći koraci čini lakšim i efikasnijim, osiguravajući minimalan gubitak ćelija i, dakle, maksimalni prinos DNK.
Uklanjanje supernatantnog
● Tehnike za supernatantno uklanjanje
Jednom kada su ćelije izgubljene, supernatant (tekućina iznad peleta) mora biti pažljivo uklonjena bez ometanja peleta ćelije. To se obično vrši pomoću mikropipeta. Ključno je izvesti ovaj korak detaljno kako ne bi izgubili bilo koje ćelije.
● Osiguravanje minimalnog gubitka peleta
Osiguravanje minimalnog gubitka ćelije na peletu uključuje pažljivo pipetiranje i, ako je potrebno, više rundi centrifugiranja i supernatantnog uklanjanja. Cilj je zadržati što više ćelija u peletu za maksimalni oporavak DNK.
Dodavanje rešenja jezgrenog lisa
● Komponente rešenja jezgre
Rješenje jezgre liza obično sadrži deterdžent (poput SDS-a), međuspremnik (kao što su Tris - HCl) i helatni agent (poput EDTA). Deterdžent narušava staničnu membranu i nuklearnu kovertu, oslobađajući mobilni sadržaj, uključujući DNK, u rješenje.
● Uloga u razbijanju ćelijskih zidova
Rešenje jezgre ne samo da se ne samo da ćelijska membrana, već denaturira proteine i lipide, učinkovito razbijaju stanične zidove i nuklearne koverte da bi se ispustile DNK u rješenje.
Resuspenzija ćelija
● nježno pipetiranje za izbjegavanje DNK šišanja
Jednom kada se doda rešenje jezgre liza, ćelije treba da budu opravdane lagano kako bi se izbjeglo da se izbegne DNK. Šišanje može prekinuti DNK na manje fragmente, što može biti problematično za nizvodne aplikacije koje zahtijevaju visoku molekularu - težinu.
● Osiguravanje potpune resuspenzije
Kompletna resuspenzija osigurava da su sve ćelije lizirane ravnomjerno, maksimizirajući oporavak DNK. To se može postići nježnim pipetom ili vrtlogom rješenja na malim brzinama.
Inkubacija u lyse ćelije
● Postavke temperature za inkubaciju
Resuspendirane ćelije se inkubiraju na određenoj temperaturi kako bi se osigurala potpuna liza. To se obično radi na 37 ° C do 55 ° C. Točna temperatura i trajanje mogu se razlikovati ovisno o protokolu i specifičnim zahtjevima korištenja izolacijskog kompleta DNK.
● Trajanje potrebno za efikasnu lizu
Tipično trajanje inkubacije je između 20 i 30 minuta, ali može se podesiti na osnovu efikasnosti primijećenog listila ćelije. Produljena inkubacija može biti potrebna za potpunu lizu, ali treba izbalansirati protiv rizika od degradacije DNK.
Hlađenje na sobnu temperaturu
● Važnost postepenog hlađenja
Nakon inkubacije, lizice se postepeno hladi na sobnu temperaturu. Postepeno hlađenje pomaže u stabilizaciji DNK i minimizira rizik od toplotnog šoka, koji bi potencijalno mogao degradirati DNK.
● efekti na DNK i stanične krhotine
Hlađenje na sobnu temperaturu omogućava da ćelijski krhotine taloži da se olakšava odvajanje DNK u narednim koracima. To takođe pomaže u stabilizaciji enzimskih aktivnosti i olakšavanje uklanjanja RNA putem Rnase tretmana.
Dodavanje Rnase rješenja
● Svrha Rnase u postupku
Rnase rješenje dodaje se u Degrade RNA, koja bi u suprotnom mogla pročistiti s DNK i miješati se s nizvodnim aplikacijama. Rnase selektivno probavlja RNA, ostavljajući DNK netaknut.
● Sprječavanje zagađenja RNA
Sprečavanje CRNA kontaminacije je ključno za aplikacije koje zahtijevaju čistu DNK, poput PCR-a i sekvenciranja. Rnase tretman osigurava da izolirani DNK bude bez kontaminanta RNA.
Pročišćavanje DNK
● Metode za odvajanje DNK iz drugih ćelijskih komponenti
Nekoliko metoda može se koristiti za pročišćavanje DNK iz Lysata. Oni uključuju ekstrakciju fenola - hloroform, etanol padavine i korištenje komercijalnih E. Coli DNA kompleta. Svaka metoda ima svoje prednosti i nedostatke, sa komercijalnim setovima koji nude praktičnost i dosljedni rezultati.
● Razmatranja za čistoću DNK
Čistoća je kritični faktor uspjeha nizvodnog primjene. Komercijalni setovi, poput ćelijske terapije E. Coli DNA kompleta dizajnirani su tako da daju visoku čistoću DNK efikasnim uklanjanjem proteina, lipida i drugih kontaminanata.
Skladištenje i rukovanje izolovanim DNK
● Najbolje prakse za skladištenje DNK
Jednom pročišćeni, DNK treba pohraniti u odgovarajućem tamponku, poput ostavke, na - 20 ° C ili - 80 ° C za dugotrajno skladištenje. Izbjegavajte česte zamrzavanje - ciklusa odmrzavanja jer mogu prouzrokovati degradaciju DNK.
● Održavanje DNK integriteta za nizvodne aplikacije
Za održavanje DNK integriteta, koristite sterilnu, nukleasene - besplatne cijevi i rješenja. To osigurava da DNK ostane nekontaminiran i pogodan za aplikacije kao što su kloniranje, sekvenciranje i PCR.
OBluekit
Jiangsu Hillgene osnovao je svoje sjedište (10.000㎡ GMP biljke i istraživanje istraživanja) u Suzhouu, smještenom u okrugu Wuzhong, Suzhou, na gradu prekrasnog Taihu Lakea i Dvije proizvodne lokalitete u Shenzhenu i Šangaju, proširujući svoju proizvodnu mrežu u cijeloj zemlji. Sjeverna Karolina u SAD-u trenutno je u izgradnji, što dalje širi globalno prisustvo. Hillgene je izgradio ekspresni put za razvijanje celijskih terapijskih proizvoda, od otkrića do isporuke, sa platformama za proizvodnju nukleinske kiseline, serum - Slobodno kulturište ovjesa, i QC testiranje. BlueKit proizvodi dizajnirani su za kontrolu kvaliteta, osiguravajući uspjeh inovacija ćelijske terapije.
Pošta: 2024 - 09 - 05 14:47:03
