Изолирането на ДНК от E. coli е основна процедура в молекулярната биология. Тази статия ще ви преведе през целия процес, предоставяйки подробни стъпки и обяснения, като гарантира, че разбирате както науката, така и практическите аспекти на процедурата. Независимо дали сте опитен изследовател или новодошъл в лабораторията, това ръководство ще бъде ценен ресурс.
Подготовка на клетъчната суспензия
● Събиране на клетки на E. coli
Първата стъпка в изолирането на ДНК от Е. coli включва събиране на бактериалните клетки. Това обикновено изисква отглеждане на E. coli в подходяща течна среда, докато достигне фазата на растеж на логаритмичния растеж. Времето е от решаващо значение, тъй като клетките в тази фаза са най -жизнеспособни и по -лесни за лизей, което ще доведе до по -висок добив на ДНК.
● Ресуспендиращи клетки в подходящ буфер
След това събраните клетки се ресуспендират в подходящ буфер. Често срещан избор е буфер Tris - EDTA (TE), който помага за поддържане на целостта на ДНК по време на процеса на извличане. Буферът служи за множество цели: стабилизира рН, хелатира двувалентните катиони, които в противен случай биха могли да разградят ДНК и осигурява оптимална йонна среда за последващи ензимни реакции.
Центрофугиране в клетките на пелети
● Параметри за центрофугиране (скорост и време)
След ресупресия на клетките, суспензията се подлага на центрофугиране, за да пелетира клетките. Скоростта на центрофугиране и времето са критични параметри. Обикновено центрофугирането се извършва при около 4000 - 6000 g за 10 - 15 минути при 4 ° C. Това гарантира, че клетките образуват плътна пелета в долната част на тръбата на центрофугата.
● Значение на правилното гранулиране
Правилното гранулиране е от съществено значение за отделяне на клетките от растежната среда и други разтворими компоненти. Кладенец - Оформената пелета прави следващите стъпки по -лесни и по -ефективни, осигурявайки минимална загуба на клетки и следователно максимален добив на ДНК.
Премахване на супернатанта
● Техники за отстраняване на супернатантата
След като клетките се гранулират, супернатантата (течността над пелетата) трябва да бъде внимателно отстранена, без да се нарушава клетъчната пелета. Това обикновено се прави с помощта на микропипета. От решаващо значение е да извършите тази стъпка щателно, за да се избегне загубата на всякакви клетки.
● Осигуряване на минимална загуба на клетъчна гранула
Осигуряването на минимална загуба на клетъчната пелета включва внимателно пипетиране и, ако е необходимо, множество кръгове на центрофугиране и отстраняване на супернатанта. Целта е да се запазят колкото се може повече клетки в пелетата за максимално възстановяване на ДНК.
Добавяне на разтвор на лизис на ядра
● Компоненти на разтвора на ядра лизис
Разтворът на ядрата лизис обикновено съдържа почистващ препарат (като SDS), буфер (като Tris - HCl) и хелиращ агент (като EDTA). Детергентът нарушава клетъчната мембрана и ядрената обвивка, освобождавайки клетъчното съдържание, включително ДНК, в разтвора.
● Роля в разграждането на клетъчните стени
Разтворът на ядрата лизис не само лизира клетъчната мембрана, но и денатурира протеините и липидите, като ефективно разгражда клетъчните стени и ядрените пликове, за да се освободи ДНК в разтвора.
Ресуспендиране на клетките
● Нежно пипетиране, за да се избегне срязване на ДНК
След като се добави разтворът за лизис на ядра, клетките трябва да се ресуспендират леко, за да се избегне срязване на ДНК. Срязването може да разгради ДНК на по -малки фрагменти, което може да бъде проблематично за приложенията надолу по веригата, които изискват високо - молекулярно - ДНК с тегло.
● Осигуряване на пълно ресуспензия
Пълното ресуспендиране гарантира, че всички клетки са лизирани равномерно, като увеличат максимално възстановяване на ДНК. Това може да се постигне чрез нежно пипетиране или вихриране на разтвора с ниска скорост.
Инкубация за лизерни клетки
● Температурни настройки за инкубация
Ресуспендираните клетки се инкубират при определена температура, за да се осигури пълен лизис. Това обикновено се прави при 37 ° C до 55 ° C. Точната температура и продължителност могат да варират в зависимост от протокола и специфичните изисквания на използвания комплект за изолация на ДНК.
● Продължителност, необходима за ефективен лизис
Типичната продължителност за инкубация е между 20 и 30 минути, но тя може да се коригира въз основа на ефективността на наблюдаваната клетъчна лизис. Продължителната инкубация може да е необходима за пълен лизис, но трябва да бъде балансирана спрямо риска от разграждане на ДНК.
Охлаждане до стайна температура
● Значение на постепенното охлаждане
След инкубацията лизатът постепенно се охлажда до стайна температура. Постепенното охлаждане помага за стабилизиране на ДНК и свежда до минимум риска от термичен шок, който потенциално би могъл да разгради ДНК.
● Ефекти върху ДНК и клетъчни отломки
Охлаждането до стайна температура позволява на клетъчните отломки да се утаи, което улеснява разделянето на ДНК в следващите стъпки. Това също помага за стабилизиране на ензимните активности и улеснява отстраняването на РНК чрез лечение с РНКАза.
Добавяне на RNase разтвор
● Цел на RNase в процедурата
RNase разтвор се добавя за разграждане на РНК, която в противен случай би могла да се пречисти с ДНК и да пречи на приложенията надолу по веригата. RNase избирателно усвоява РНК, оставяйки ДНК непокътната.
● Предотвратяване на замърсяване на РНК
Предотвратяването на замърсяване на РНК е от решаващо значение за приложения, които изискват чиста ДНК, като PCR и секвениране. Лечението с RNase гарантира, че изолираната ДНК е без замърсители на РНК.
Пречистване на ДНК
● Методи за отделяне на ДНК от други клетъчни компоненти
Няколко метода могат да се използват за пречистване на ДНК от лизата. Те включват екстракция на фенол - хлороформ, утаяване на етанол и използване на търговски комплекти E. coli DNA. Всеки метод има своите плюсове и минуси, като търговските комплекти предлагат удобство и последователни резултати.
● Съображения за чистотата на ДНК
Чистотата е критичен фактор за успеха на приложенията надолу по веригата. Търговските комплекти, като клетъчната терапия E. coli DNA комплект, са проектирани да дават висока - чистота ДНК чрез ефективно отстраняване на протеини, липиди и други замърсители.
Съхранение и боравене с изолирана ДНК
● Най -добри практики за съхранение на ДНК
След като се пречисти, ДНК трябва да се съхранява в подходящ буфер, като TE буфер, при - 20 ° C или - 80 ° C за дълго - срочно съхранение. Избягвайте често замръзване - цикли на размразяване, тъй като те могат да причинят разграждане на ДНК.
● Поддържане на целостта на ДНК за приложения надолу по веригата
За да поддържате целостта на ДНК, използвайте стерилни, нуклеазни - Безплатни епруветки и разтвори. Това гарантира, че ДНК остава незамърсена и подходяща за приложения като клониране, секвениране и PCR.
ОколоBluekit
Jiangsu Hillgene създаде своя щаб (10 000 ㎡ GMP растения и R&D център) в Сучжоу, разположен в област Вуджонг, Сучжоу, град на езерото на красивото езеро Тайху и две производствени обекти в Шенжен и Шанхай, разширявайки производствената си мрежа в цялата страна. Сайтът в Северна Каролина в САЩ в момента се строи, като допълнително разпространява глобалното си присъствие. Hillgene е изградил експресен път за разработване на продукти за клетъчна терапия, от откриване до доставка, с платформи за производство на нуклеинова киселина, серум - Култивиране на безплатно окачване, разработка на затворени процеси и тестване на QC. Продуктите Bluekit са предназначени за контрол на качеството, като гарантират успеха на иновациите в клетъчната терапия.
Време за публикация: 2024 - 09 - 05 14:47:03
