Вылучэнне ДНК з кішачнай палачкі з'яўляецца асноўнай працэдурай у малекулярнай біялогіі. Гэты артыкул правядзе вас праз увесь працэс, даючы падрабязныя крокі і тлумачэнні, гарантуючы, што вы разумееце як навуку, так і практычныя аспекты працэдуры. Незалежна ад таго, што вы дасведчаны даследчык ці пачатковец у лабараторыі, гэта кіраўніцтва стане каштоўным рэсурсам.
Падрыхтоўка клеткавай завісі
● Збор клетак кішачнай палачкі
Першы крок у ізаляцыі ДНК ад кішачнай палачкі ўключае ў сябе збор бактэрыяльных клетак. Звычайна гэта патрабуе вырошчвання кішачнай палачкі ў прыдатнай вадкім асяроддзі, пакуль яна не дасягне фазы лагарыфмічнага росту. Тэрміны маюць вырашальнае значэнне, паколькі клеткі ў гэтай фазе найбольш жыццяздольныя і прасцей у лізе, што прывядзе да павышэння ўраджаю ДНК.
● Адкрыйце вочкі ў адпаведным буферы
Затым сабраныя клеткі рэсуспендуюць у прыдатным буферы. Агульны выбар - гэта буфер Tris - EDTA (TE), які дапамагае падтрымліваць цэласнасць ДНК падчас працэсу экстракцыі. Буфер служыць некалькім мэтам: ён стабілізуе рН, хелаты -дивалентныя катыёны, якія ў адваротным выпадку могуць пагоршыць ДНК, і забяспечвае аптымальную іённую сераду для наступных ферментатыўных рэакцый.
Цэнтрафугаванне да клетак гранул
● Параметры для цэнтрафугавання (хуткасць і час)
Пасля аднаўлення клетак падвеска падвяргаецца цэнтрабежнасці гранул клетак. Хуткасць і час цэнтрафугавання з'яўляюцца крытычнымі параметрамі. Звычайна цэнтрафугаванне праводзіцца прыблізна на 4000 - 6000 г на працягу 10 - 15 хвілін пры 4 ° С. Гэта гарантуе, што клеткі ўтвараюць шчыльную гранулу на дне трубы цэнтрабежнай.
● Важнасць правільнага гранулявання
Правільнае грануляванне мае важнае значэнне для аддзялення клетак ад асяроддзя росту і іншых растваральных кампанентаў. Свідравіна - утвараецца гранулы палягчаюць наступныя этапы больш простымі і эфектыўнымі, забяспечваючы мінімальную страту клетак і, такім чынам, максімальны выхад ДНК.
Выдаленне супернатанта
● Метады для выдалення супернатанта
Пасля таго, як клеткі будуць грануляваны, супернатант (вадкасць над гранулам) трэба старанна выдаляць, не парушаючы клеткавы гранул. Звычайна гэта робіцца пры дапамозе мікрапіпеты. Важна зрабіць гэты крок дбайна, каб пазбегнуць страты любых клетак.
● Забеспячэнне мінімальнай страты клеткавай гранулы
Забеспячэнне мінімальнай страты клеткавай гранулы прадугледжвае дбайнае піпета і, пры неабходнасці, некалькі раўндаў цэнтрафугавання і выдаленне супернатанта. Мэта складаецца ў тым, каб захаваць як мага больш клетак у гранулах для максімальнага аднаўлення ДНК.
Даданне раствора лізісу ядраў
● Кампаненты раствора лізісу ядраў
Раствор лізісу ядраў звычайна ўтрымлівае мыйны сродак (напрыклад, SDS), буфер (напрыклад, Tris - HCl) і хелатыруючы сродак (напрыклад, EDTA). Мыйны сродак парушае клеткавую мембрану і ядзерную абалонку, вылучаючы ў раствор клеткавы змест, у тым ліку ДНК.
● Роля ў разбурэнні клеткавых сценак
Раствор лізісу ядраў не толькі лізіруе клеткавую мембрану, але і дэнатурызуе вавёркі і ліпіды, эфектыўна разбураючы клеткавыя сценкі і ядзерныя канверты, каб вызваліць ДНК у раствор.
Рэсуспензія клетак
● Пяшчотны піпецінг, каб пазбегнуць стрыжкі ДНК
Пасля таго, як дадаецца раствор ядра ядра, клеткі трэба мякка рэсуспендуе, каб пазбегнуць стрыжкі ДНК. Зрэз можа разбіць ДНК на меншыя фрагменты, якія могуць быць праблематычнымі для прымянення ўніз па плыні, якія патрабуюць высокай - малекулярнай - вагі ДНК.
● Забеспячэнне поўнага рэспубліканцаў
Поўная рэсуспенія гарантуе, што ўсе клеткі раўнамерна лізіруюць, максімальна павялічваючы аднаўленне ДНК. Гэта можа быць дасягнута мяккім піпетам або віхурай раствора з нізкай хуткасцю.
Інкубацыя да клетак лізы
● Налады тэмпературы для інкубацыі
Рэсуспендуемыя клеткі інкубуюць пры пэўнай тэмпературы, каб забяспечыць поўную лізіс. Звычайна гэта робіцца пры 37 ° С да 55 ° С. Дакладная тэмпература і працягласць могуць вар'іравацца ў залежнасці ад пратакола і канкрэтных патрабаванняў набору для ізаляцыі ДНК.
● Працягласць, неабходная для эфектыўнага лізісу
Тыповая працягласць інкубацыі складае ад 20 да 30 хвілін, але яе можна рэгуляваць на аснове эфектыўнасці назіранага лізісу клетак. Для поўнага лізісу можа спатрэбіцца працяглая інкубацыя, але павінна быць збалансавана з рызыкай дэградацыі ДНК.
Астуджэнне да пакаёвай тэмпературы
● Важнасць паступовага астуджэння
Пасля інкубацыі лізат паступова астуджаецца да пакаёвай тэмпературы. Паступовае астуджэнне дапамагае ў стабілізацыі ДНК і мінімізуе рызыку цеплавога шоку, які патэнцыйна можа пагоршыць ДНК.
● Уплыў на ДНК і клеткавы смецце
Астуджэнне да пакаёвай тэмпературы дазваляе клеткавым смеццем абсачыць, што палягчае аддзяленне ДНК на наступных этапах. Гэта таксама дапамагае стабілізаваць дзейнасць ферментаў і палягчае выдаленне РНК пры дапамозе RNase.
Даданне раствора РНКазы
● Мэта РНКазы ў працэдуры
Раствор RNase дадаецца ў дэградавую РНК, якая ў адваротным выпадку можа ачысціць ДНК і перашкаджаць прымяненнем уніз па плыні. РНКаза выбарачна пераварвае РНК, пакідаючы ДНК некранутай.
● Прафілактыка забруджвання РНК
Прадухіленне забруджвання РНК мае вырашальнае значэнне для прымянення, якія патрабуюць чыстай ДНК, напрыклад, ПЦР і паслядоўнасці. Лячэнне РНКазы гарантуе, што ізаляваная ДНК не знаходзіцца ад забруджванняў РНК.
Ачышчэнне ДНК
● Метады аддзялення ДНК ад іншых клеткавых кампанентаў
Некалькі метадаў можна выкарыстоўваць для ачысткі ДНК ад лізата. Сюды ўваходзяць фенол - экстракцыя хлараформа, ападкі этанолу і выкарыстанне камерцыйных набораў ДНК кішачнай палачкі. Кожны метад мае свае плюсы і мінусы, пры гэтым камерцыйныя наборы прапануюць зручнасць і паслядоўныя вынікі.
● Меркаванні па чысціні ДНК
Чысціня з'яўляецца крытычным фактарам поспеху ўніз па ходзе. Камерцыйныя наборы, такія як клеткавая тэрапія, набор ДНК кішачнай палачкі, прызначаны для атрымання высокай - ДНК чысціні шляхам эфектыўнага выдалення бялкоў, ліпідаў і іншых забруджванняў.
Захоўванне і кіраванне ізаляванай ДНК
● Лепшыя практыкі для захоўвання ДНК
Пасля ачышчэння ДНК павінна захоўвацца ў прыдатным буферы, напрыклад, буферы TE, пры - 20 ° C або - 80 ° C на працягу доўгага - тэрміновага захоўвання. Пазбягайце частага замарожвання - цыклы адтавання, бо яны могуць выклікаць дэградацыю ДНК.
● Падтрыманне цэласнасці ДНК для прымянення ўніз па плыні
Для падтрымання цэласнасці ДНК выкарыстоўвайце стэрыльную, нуклеазу - бясплатныя трубы і растворы. Гэта гарантуе, што ДНК застаецца незамежанай і прыдатнай для такіх прыкладанняў, як кланаванне, паслядоўнасць і ПЦР.
ПраBluekit
Jiangsu Hillgene стварыў штаб -кватэру (заводы GMP і R&D Center) у Сучжоу, размешчаны ў раёне Вучжога, Сучжоу, горад -лезера цудоўнага возера Тайху, і два вытворчыя пляцоўкі ў Шэньчжэне і Шанхай, пашыраючы сеткавую сетку вытворчасці. У цяперашні час знаходзіцца сайт Паўночнай Караліны ў ЗША, што яшчэ больш распаўсюджвае сваю глабальную прысутнасць. Hillgene пабудаваў выразны шлях для распрацоўкі прадуктаў клеткавай тэрапіі: ад выяўлення да дастаўкі, з платформамі для вырабу нуклеінавых кіслот, сыроваткі - свабоднай вырошчвання завісі, закрытым працэсам і тэставаннем QC. Прадукты Bluekit распрацаваны для кантролю якасці, забяспечваючы поспех інавацый сотавай тэрапіі.
Час паведамлення: 2024 - 09 - 05 14:47:03
