E. Coli-dən DNT təcrid etmək, molekulyar biologiyanın əsas prosedurudur. Bu məqalə, həm elmin, həm də prosedurun praktik aspektlərini başa düşməyinizi təmin edərək, bu məqalə bütün prosesi və izahatlar, ətraflı addımlar və izahatlar təmin edəcəkdir. Laboratoriyaya təcrübəli tədqiqatçı və ya yeni gələn bir tədqiqatçı olsanız, bu bələdçi dəyərli bir qaynaq olacaqdır.
Hüceyrə dayandırılmasının hazırlanması
● E. coli hüceyrələrinin toplanması
E. Coli-dən DNT-nin təcrid edilməsində ilk addım bakterial hüceyrələrin toplanması daxildir. Bu, ümumiyyətlə, Logaritmik böyümə mərhələsinə çatana qədər uyğun bir maye mühitdə böyüməkdən istifadə edir. Zamanlama çox vacibdir, çünki bu mərhələdəki hüceyrələr daha çox DNT məhsulu ilə nəticələnəcək lyse və daha asandır.
● Müvafiq bir tampondakı hüceyrələri bərpa edin
Toplanan hüceyrələr daha sonra uyğun bir tamponda yenidən qurulur. Ortaq bir seçim bir Trisdir. - Edta (TE) tampon, bu, hasilat zamanı DNT-nin bütövlüyünü qorumağa kömək edir. Bufer çox məqsədlidir: DNT-ni daha da pisləşdirə bilən pH, Chelates divinal kationlarını sabitləşdirir və sonrakı fermentatik reaksiyalar üçün optimal ion mühiti təmin edir.
Qranul hüceyrələrinə sentrifugasiya
● sentrifugasiya üçün parametrlər (sürət və vaxt)
Hüceyrələri yenidən qurduqdan sonra, dayandırılması hüceyrələri qranul etmək üçün santrifugiyaya məruz qalır. Centrifugugation sürəti və vaxtı kritik parametrlərdir. Tipik olaraq, sentrifumə təxminən 4000 - 6000 g 10 - 15 dəqiqə 4 ° C-də. Bu, hüceyrələrin mərkəzdənqurdu borusunun altındakı dar bir pellet meydana gətirməsini təmin edir.
● Düzgün pelletingin əhəmiyyəti
Hüceyrələri böyümə mühitindən və digər həll olunan komponentlərdən ayırmaq üçün düzgün pelleting vacibdir. Bir quyu - Yaranmış qranul, sonrakı addımları daha asan və səmərəli edir, maksimum DNT məhsuldarlığının minimal itkisini və daha səmərəli olmasını təmin edir.
Fövqəladə çıxarılması
● Fövqəladə çıxarılması üçün üsullar
Hüceyrələr pelleted olduqdan sonra fövqəladə (qranuldan yuxarı maye) hüceyrə qranulunu pozmadan diqqətlə çıxarılmalıdır. Bu ümumiyyətlə mikropipette istifadə edərək edilir. Hər hansı bir hüceyrəni itirmək üçün bu addımı diqqətlə yerinə yetirmək çox vacibdir.
● Hüceyrə qranulunun minimal itkisini təmin etmək
Hüceyrə qranulunun minimal itkisinin təmin edilməsi, zəruri hallarda, birdən çox sentrifugation və fövqəladə aradan qaldırılmasıdır. Məqsəd maksimum DNT bərpa etmək üçün qranulda mümkün qədər çox hüceyrəni saxlamaqdır.
Nuklei lizi həllinin əlavə edilməsi
● nuklei lizis həllinin komponentləri
Nuklei lizi həllində adətən bir yuyucu bir yuyucu (SDS kimi), bir tampon (Tris kimi) kimi bir tampon və chelating agenti (EDTA kimi) ehtiva edir. Yuyucu vasitə hüceyrə membranını və nüvə zərfini, DNT daxil olmaqla, DNT-nin həlli daxil olduğu mobil məzmunu sərbəst buraxır.
● Hüceyrə divarlarını parçalamaqda rol
Nuklei lizi həlli yalnız hüceyrə membranı deyil, həm də DNT-ni həll etmək üçün hüceyrə divarlarını və nüvə zərflərini effektiv şəkildə parçalayan, həm də zülal və lipidləri, həm də lipsidləri və nüvə zərflərini azaldır.
Hüceyrələrin reantı
● DNT-nin kəsilməsinin qarşısını almaq üçün incə boru kəməri
Nuklei lizis həlli əlavə edildikdən sonra, hüceyrələr DNT-nin kəsilməsinin qarşısını almaq üçün yumşaq bir şəkildə yenidən qurulmalıdır. Qırılma, DNT-ni yüksək səviyyədə tələb edən aşağısıntılar üçün problemli ola bilən daha kiçik parçaları qıra bilər.
● Tam reanimasiyanı təmin etmək
Tam Rəssamlıq, bütün hüceyrələrin hamısının eyni şəkildə liz olunmasını təmin edir, DNT bərpaini artırır. Buna incə boru kəməri və ya həllini aşağı sürətlə həll etməklə nail olmaq olar.
Lyse hüceyrələrinə inkubasiya
● İnkubasiya üçün temperatur parametrləri
Resultifner hüceyrələri tam lizisini təmin etmək üçün müəyyən bir temperaturda inkubasiya olunur. Bu ümumiyyətlə 37 ° C-dən 55 ° C-ə qədər edilir. Dəqiq temperatur və müddəti protokoldan asılı olaraq və DNT izolyasiya dəstinin xüsusi tələblərinə görə dəyişə bilər.
● effektiv lizis üçün tələb olunan müddət
İnkubasiya üçün tipik müddəti 20 ilə 30 dəqiqə arasındadır, lakin müşahidə olunan hüceyrə lizisinin səmərəliliyinə əsasən tənzimlənə bilər. Tamamlanmış inkubasiya tam liziz üçün lazım ola bilər, lakin DNT deqradasiyası riskinə görə balanslı olmalıdır.
Otaq temperaturuna soyutma
● tədricən soyutmanın əhəmiyyəti
İnkubasiya etdikdən sonra lizat tədricən otaq temperaturuna qədər soyudulur. Tədricən soyutma DNT-ni sabitləşdirməyə kömək edir və DNT-ni potensial pisləşdirə biləcək istilik şok riskini minimuma endirir.
● DNT və mobil zibillərə təsir göstərir
Otaq temperaturuna qədər soyutma, mobil zibilin çökməsinə imkan verir, sonrakı addımlarda DNT-ni ayırmağı asanlaşdırır. Bu da ferment fəaliyyətlərini sabitləşdirməyə və RNA-nın rnase müalicəsi ilə çıxarılmasını asanlaşdırmağa kömək edir.
Rnase həllinin əlavə edilməsi
● prosedurda rnazın məqsədi
RNase həlli RNA-nı pisləşdirmək üçün əlavə olunur, əks halda CO - DNT ilə təmizlənə bilər və aşağı tətbiqlərə müdaxilə edir. Rnase, DNT-ni bütöv buraxaraq RNT-ni seçən RNA-nı həzm edir.
● RNT çirklənməsinin qarşısını alır
RNT çirklənməsinin qarşısını alır PRCR və ardıcıllıqla saf DNT tələb edən tətbiqlər üçün çox vacibdir. Rnase müalicəsi, təcrid olunmuş DNT-nin RNT çirkləndiricilərindən azad olmasını təmin edir.
DNT-nin təmizlənməsi
● DNT-ni digər hüceyrə komponentlərindən ayırmaq üçün metodlar
DNT-ni lysatdan təmizləmək üçün bir neçə üsuldan istifadə edilə bilər. Bunlara fenol daxildir - xloroform çıxarılması, etanol yağıntıları və kommersiya E. Coli DNT dəstlərindən istifadə etməklə. Hər bir üsul, rahatlıq və ardıcıl nəticələr verən kommersiya dəstləri ilə müsbət və mənfi cəhətləri var.
● DNT saflığı üçün mülahizələr
Saflıq, aşağı tətbiqlərin müvəffəqiyyəti üçün kritik bir amildir. Cell Therapy E. Coli DNT Kit kimi kommersiya dəstləri, yüksək qiymət vermək üçün hazırlanmışdır.
Təcrid olunmuş DNT-nin saxlanması və işlənməsi
● DNT-ni saxlamaq üçün ən yaxşı təcrübələr
Bir dəfə təmizlənmiş, DNT, TE Bufer kimi, Te Bufer kimi, Uzunlar üçün 20 ° C və ya $ 80 ° C - Termin anbarı kimi bir tamponda saxlanılmalıdır. Tez-tez dondurulmadan çəkinin - DNT deqradasiyasına səbəb ola biləcəyi üçün dövr tkanslar.
● Daxili tətbiqlər üçün DNT bütövlüyünün qorunması
DNT bütövlüyünü qorumaq üçün steril, nuklease istifadə edin. Pulsuz borular və həllər. Bu, DNT-nin klonlama, ardıcıllıqla və PCR kimi tətbiqlər üçün uyğun olmayan və uyğun olmasını təmin edir.
HaqqındaBlukit
Jiangsu Hillgene, Suzhong rayonu, SuzhoN rayonu, SuzhoN rayonu, Suzhou, Lakeshore şəhərinin yerləşdiyi və Şenzhen və Şenzhayda olan iki istehsal yeri olan Suzhou və Şenzhen şəhərində yerləşən Suzhou-da (10.000㎡ GMP Bitkiləri və R & D Center) quruldu. ABŞ-dakı Şimali Karolina saytı hazırda qlobal varlığını daha da yaymaqdadır. Hillgene, mobil terapiya məhsullarının hazırlanmasında, kəşfi tədarükün, nuklein turşusu istehsalı üçün platformalar, serum - sərbəst asma mədəniyyət, qapalı prosesin inkişafı və QC testi üçün platformalarını inkişaf etdirmək üçün təcavüzkar bir yol qurdu. Blukit məhsulları, mobil terapiya yeniliklərinin müvəffəqiyyətini təmin edərək keyfiyyətə nəzarət üçün hazırlanmışdır.
Time Time: 2024 - 09 - 05 14:47:03
