Isolering van DNA van E. coli is 'n fundamentele prosedure in molekulêre biologie. Hierdie artikel sal u deur die hele proses lei, met gedetailleerde stappe en verduidelikings, en verseker dat u sowel die wetenskap as die praktiese aspekte van die prosedure verstaan. Of u nou 'n ervare navorser of 'n nuweling in die laboratorium is, hierdie gids sal 'n waardevolle bron wees.
Voorbereiding van die selsuspensie
● Versameling van E. coli -selle
Die eerste stap in die isolerende DNA van E. coli behels die versameling van die bakteriese selle. Dit verg gewoonlik groeiende E. coli in 'n geskikte vloeistofmedium totdat dit die logaritmiese groeifase bereik. Die tydsberekening is van kardinale belang omdat selle in hierdie fase die beste is en makliker is om te dryf, wat 'n hoër DNA -opbrengs sal lei.
● Resuspending selle in 'n toepaslike buffer
Versamelde selle word dan in 'n geskikte buffer gesuspendeer. 'N Algemene keuse is 'n Tris - edta (TE) -buffer, wat help om die integriteit van die DNA tydens die ekstraksieproses te handhaaf. Die buffer dien veelvuldige doeleindes: dit stabiliseer die pH, Chelate Divalent Cations wat andersins DNA kan afbreek, en bied 'n optimale ioniese omgewing vir daaropvolgende ensiematiese reaksies.
Sentrifugering na korrelselle
● Parameters vir sentrifugering (spoed en tyd)
Nadat die selle weer gesuspbel is, word die suspensie aan sentrifugering onderwerp om die selle te korrel. Sentrifugaspoed en -tyd is kritieke parameters. Tipies word sentrifugasie uitgevoer teen ongeveer 4,000 - 6,000 g vir 10 - 15 minute by 4 ° C. Dit verseker dat die selle 'n stywe korrel aan die onderkant van die sentrifuge -buis vorm.
● Belangrikheid van behoorlike korrel
Behoorlike korrel is noodsaaklik om die selle van die groeimedium en ander oplosbare komponente te skei. 'N Put - gevormde korrel maak die daaropvolgende stappe makliker en doeltreffender, wat minimale verlies aan selle verseker en dus die maksimum DNA -opbrengs.
Verwydering van supernatant
● Tegnieke vir die verwydering van supernatant
Sodra die selle gepil is, moet die supernatant (die vloeistof bokant die korrel) noukeurig verwyder word sonder om die selkorrel te versteur. Dit word gewoonlik met behulp van 'n mikropipet gedoen. Dit is uiters belangrik om hierdie stap noukeurig uit te voer om te verhoed dat u selle verloor.
● Verseker minimale verlies aan selkorrel
Die versekering van minimale verlies aan die selkorrel behels noukeurige pipetwerk en, indien nodig, verskeie rondes van sentrifugering en die verwydering van supernatante. Die doel is om soveel selle as moontlik in die korrel te hou vir maksimum DNA -herstel.
Toevoeging van die oplossing van die kerne -lysis
● Komponente van die oplossing van die kernlysis
Die oplossing van die kerne -lysisering bevat tipies 'n skoonmaakmiddel (soos SDS), 'n buffer (soos Tris - HCl) en 'n chelateringsmiddel (soos EDTA). Die skoonmaakmiddel ontwrig die selmembraan en kernomhulsel, wat die sellulêre inhoud, insluitend DNA, in die oplossing vrystel.
● Rol in die afbreek van selwande
Die kernlysisoplossing lys nie net die selmembraan nie, maar denaturiseer ook proteïene en lipiede, wat die selwande en kernkoeverte effektief afbreek om DNA in die oplossing vry te laat.
Resuspensie van selle
● Sagte pipet om DNA te vermy
Sodra die kernlysisoplossing bygevoeg is, moet die selle saggies gesuspendeer word om DNA -skuif te voorkom. Skeer kan die DNA in kleiner fragmente verdeel, wat problematies kan wees vir stroomaf -toepassings wat 'n hoë molekulêre - gewig DNA benodig.
● Verseker volledige resuspensie
Volledige resuspensie verseker dat alle selle eenvormig gelys word, wat die DNA -herstel maksimeer. Dit kan bewerkstellig word deur die oplossing met 'n sagte pipet of omdraaipaneel teen 'n lae snelheid.
Inkubasie tot Lyse -selle
● Temperatuurinstellings vir inkubasie
Die gesuspendeerde selle word by 'n spesifieke temperatuur geïnkubeer om volledige lysis te verseker. Dit word gewoonlik by 37 ° C tot 55 ° C gedoen. Die presiese temperatuur en duur kan wissel afhangende van die protokol en die spesifieke vereistes van die DNA -isolasiekit wat gebruik word.
● Duur benodig vir effektiewe lysis
Die tipiese tydsduur vir inkubasie is tussen 20 en 30 minute, maar dit kan aangepas word op grond van die doeltreffendheid van die waargenome sellys. Langdurige inkubasie kan nodig wees vir volledige lysis, maar moet gebalanseer word teen die risiko van DNA -agteruitgang.
Koel tot kamertemperatuur
● Belangrikheid van geleidelike verkoeling
Na inkubasie word die lysaat geleidelik tot kamertemperatuur afgekoel. Geleidelike verkoeling help om die DNA te stabiliseer en verminder die risiko van termiese skok, wat die DNA moontlik kan verneder.
● Effekte op DNA en sellulêre puin
Verkoeling tot kamertemperatuur laat die sellulêre puin toe om te presipiteer, wat dit makliker maak om die DNA in die daaropvolgende stappe te skei. Dit help ook om die ensiemaktiwiteite te stabiliseer en vergemaklik die verwydering van RNA deur RNase -behandeling.
Toevoeging van RNase -oplossing
● Doel van RNase in die prosedure
RNase -oplossing word bygevoeg om RNA te degradeer, wat andersins met die DNA kan suiwer en met stroomaf toepassings kan belemmer. RNase verteer RNA selektief en laat die DNA ongeskonde.
● Voorkoming van RNA -besmetting
Die voorkoming van RNA -besmetting is van uiterste belang vir toepassings wat suiwer DNA benodig, soos PCR en volgorde. Die RNase -behandeling verseker dat die geïsoleerde DNA vry is van RNA -kontaminante.
Suiwering van DNA
● Metodes om DNA van ander sellulêre komponente te skei
Verskeie metodes kan gebruik word om DNA van die lysaat te suiwer. Dit sluit in fenol - chloroform -ekstraksie, etanol -neerslag en die gebruik van kommersiële E. coli DNA -stelle. Elke metode het sy voor- en nadele, met kommersiële stelle wat gemak en konsekwente resultate bied.
● Oorwegings vir DNA -suiwerheid
Suiwerheid is 'n kritieke faktor vir die sukses van stroomaf toepassings. Kommersiële stelle, soos die selterapie E. coli DNA -kit, is ontwerp om hoë -suiwerheid DNA te lewer deur proteïene, lipiede en ander kontaminante effektief te verwyder.
Berging en hantering van geïsoleerde DNA
● Beste praktyke vir die berging van DNA
Sodra dit gesuiwer is, moet DNA in 'n geskikte buffer, soos TE -buffer, by - 20 ° C of - 80 ° C geberg word vir lang termynberging. Vermy gereelde vriespunt - Ontdooi siklusse, aangesien dit DNA -agteruitgang kan veroorsaak.
● Die handhawing van DNA -integriteit vir stroomaf toepassings
Gebruik steriele, nuklease - gratis buise en oplossings om DNA -integriteit te handhaaf. Dit verseker dat die DNA onbesmet en geskik bly vir toepassings soos kloning, opeenvolging en PCR.
RondomBloukit
Jiangsu Hillgene het sy hoofkwartier (10.000 GMP -aanlegte en R & D -sentrum) in Suzhou gevestig, geleë in die Wuzhong -distrik, Suzhou, 'n lakeshore -stad van die pragtige Taihu -meer, en twee vervaardigingswebwerwe in Shenzhen en Shanghai, wat die vervaardigingsnetwerk se nasionale landwye uitgebrei het. Die Noord -Carolina -terrein in die VSA is tans in aanbou, wat sy wêreldwye teenwoordigheid verder versprei. Hillgene het 'n uitdruklike weg gebou vir die ontwikkeling van sellulêre terapieprodukte, van ontdekking tot aflewering, met platforms vir nukleïensuurvervaardiging, serum - gratis suspensie -verbouing, geslote prosesontwikkeling en QC -toetsing. Bluekit -produkte is ontwerp vir kwaliteitskontrole, wat die sukses van sellulêre terapie -innovasies verseker.
Postyd: 2024 - 09 - 05 14:47:03
